导读 微生物代谢组学主要研究细胞内或细胞外初级代谢物、信号分子、激素和次级代谢物的分析，是系统生物学的一个重要领域。微生物代谢组学进展缓慢主要是由于微生物代谢物的复杂性和多样性，这些代谢物通常难以识别。然而，随着新型分析技术的快速发展，微生物代谢组学不仅阐明了各种代谢途径的网络，而且阐明了微生物与宿主之间相互作用的机制，因此越来越受到人们的关注。本综述讨论了当前微生物代谢组学的最新技术，包括仪器平台、样品制备方法、数据处理以及分析工具和资源。此外，我们还描述了与微生物代谢组学相关的最新应用和挑战。
论文ID
原名：Microbial metabolomics: From novel technologies to diversified applications
译名：微生物代谢组学：从新技术到多样化应用
期刊：TrAC Trends in Analytical Chemistry
IF：14.908
发表时间：2022.1
通讯作者：沈建忠＆夏曦
通讯作者单位：中国农业大学动物医学院
DOI号：10.1016/j.trac.2022.116540
综述目录
1 前言
2 分析工具和方法
2.1 NMR
2.2 MS
2.3 样品制备
2.4 数据处理和分析
3 微生物代谢组学的应用
3.1 确定未知基因的功能
3.2 微生物鉴定
3.3 微生物代谢途径
3.4 抗生素耐药性
3.5 环境微生物代谢与群落
3.6 肠道微生物代谢与疾病
3.7 工业发酵的改进
3.8 合成生物学
3.9 酶的发现
4 结论
主要内容
1 前言
微生物代谢组学利用代谢组学方法对微生物整个生命周期或特定生理周期中的低分子量(＜1500 Da)代谢产物、激素和信号分子进行定性和定量分析。该领域旨在从代谢产物的变化来解释微生物与表型之间的相互关系和信息流，从而进一步了解微生物的生理状态。作为系统生物学发展最快的领域之一，微生物代谢组学能够提供有关微生物实际生理状态的准确信息或反映其对宿主代谢的影响。
1998年，Tweeddale等人报道了第一项微生物代谢组学研究，该研究使用二维薄层色谱法分析了生长缓慢的大肠杆菌的整体代谢谱变化。目前，微生物代谢组学已被广泛应用于生物学和生物医学的各个领域，以研究微生物的抗生素耐药性和致病机制，并发现新的细菌种类、功能基因和天然产物。虽然微生物代谢组学的研究已经有了一些综述，但对目前微生物代谢组学的研究策略缺乏全面、深入的总结。本文就这一知识空白进行了综述，并总结了微生物代谢组学的最新分析技术、样品制备和数据处理的现状，以及与微生物代谢组学相关的最新应用和挑战。
2 分析工具和方法
近20年来，微生物代谢组学研究呈指数增长(图1A)，而气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等分离技术已成为该领域常用的工具(图1B)。此外，其他分析方法，如核磁共振(NMR)，已被广泛使用。此外，研究人员已经开始使用多种技术。
图1 微生物代谢组学相关文献调查。
(A) 1998年至2020年PubMed期刊标题、摘要或关键词中含有“微生物代谢组学”或“细菌/代谢组学”和“NMR、GC-MS、LC-MS、CE-MS、DI-MS或薄层色谱”的研究论文；(B)饼状图代表微生物代谢组学中最常用的工具。
2.1 NMR
基于核磁共振(NMR)的代谢组学具有高度可重复性，并且可以通过整合质子NMR信号来量化识别的代谢物。与LC-MS和GC-MS相比，NMR可以更好地分析难以电离、需要衍生化或浓度极高的化合物。但核磁共振的主要缺点是灵敏度差、分离能力差。微生物代谢物的组成很复杂，其浓度可从pmol/L到mmol/L不等。因此，NMR的低灵敏度限制了其在微生物代谢组学中的广泛应用。
此外，定量方法和商业软件的可用性通常是有限的。近年来，随着磁体技术的发展，特别是永磁体、无液氦超导磁体和自旋超极化技术的发展，NMR的便利性、成本效益和灵敏度得到了提高。近年来，基于NMR的微生物代谢组学结合稳定同位素标记技术，提高了NMR的检测能力，已被用于阐明天然水生细菌群落的代谢物转化模式。
2.2 MS
近年来，质谱技术的快速发展提高了其灵敏度和分离效率；因此，MS已成为代谢物分析的前沿技术。几种MS技术，如飞行时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)和轨道阱质谱仪器，提供了不同的灵敏度、准确度和分辨率。在分析微生物代谢组学样品时，通常将MS和高通量分离技术串联起来，包括GC、LC、超高效液相色谱(UHPLC)、毛细管电泳(CE)，极大地促进了微生物代谢组学领域的发展(图2)。
图2 用于微生物代谢组学的质谱仪。
2.2.1 GC-MS
GC-MS的主要优点是分离效率高、使用方便、稳健性、成本效益高。Zhao等人利用GC-TOF/MS建立了145种氯甲酸乙酯和氯甲酸甲酯衍生物的MS和保留指数库，实现了大肠杆菌中多种代谢物的自动高通量鉴定和定量。由于其具有更高的分辨率、质量准确度和更高的灵敏度，Orbitrap MS在代谢组学分析中表现出了优越的性能。Qiu等人利用GC-TOF/MS和GC-Orbitrap/MS使用同位素比异常值分析峰值检测来研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢组。使用GC-Orbitrap/MS和GC-TOF/MS鉴定的代谢产物的平均质量偏差分别为1.48 ppm和32.2 ppm。
与GC-TOF/MS相比，GC-Orbitrap/MS检测到的峰对数量几乎是GC-TOF/MS的两倍。二维气相色谱(GC×GC)通常与TOF/MS联用，可以为代谢组学分析提供更好的色谱分离。Loots等人使用GC×GC-TOF/MS鉴定耐利福平结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的重要代谢标志物，而Winnike等人比较了GC-MS和GC×GC-MS鉴定代谢标志物的性能。GC×GC-MS检测到的峰和代谢物的数量大约是GC-MS的3倍。GC×GC-MS数据分析过程繁琐，限制了其广泛应用。新型生物信息工具的出现大大缩短了GC×GC-MS数据处理的时间，使得这项技术在大规模代谢组学研究中非常可行。
衍生化是一个关键过程，需要对基于GC-MS的代谢组学进行仔细标准化，特别是在非靶向代谢组学方法中。高效、可重复的衍生化方法是GC-MS代谢组学的关键。Miyagawa等人利用顺序衍生化和间隔注射成功地获得了52种选定代谢物峰面积的良好重复性。此外，衍生化时间和试剂用量不同，不同代谢物的最佳衍生化条件也不同。Zhang等人开发了一种可靠、方便、灵敏的方法，使用硫酸钠脱水预处理和基于O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺衍生化的GC-MS分析来测定粪便样品肠道微生物群中短链脂肪酸和其他挥发性化合物的量。
2.2.2 LC-MS
在过去十年中，LC-MS在涉及微生物代谢组学分析的研究中日益占主导地位。然而，使用非靶向代谢组学识别大量检测到的离子仍然是该技术有效性的主要瓶颈。混合质谱提供了多种碎裂模式，为结构表征和代谢物注释提供了多种工具。最近，离子迁移谱(IMS)在基于LC-MS的代谢组学研究中广受欢迎，IMS在MS分析前提供额外的代谢物离子的气相分离，而不损失总样品通量。IMS产生的离子碰撞截面值将显著提高非靶向代谢组学分析中未知代谢物注释的准确性和覆盖率。除了使用LC-HRMS对生物系统中的全部代谢物进行非靶向分析外，靶向代谢组学还专门侧重于识别和量化选定的代谢物。它还具有从系统水平的绝对代谢物浓度识别细胞代谢的能力。
Bennett等人利用LC-QqQ/MS定量分析了在葡萄糖、甘油或乙酸等碳源中呈指数生长的好氧大肠杆菌中100多种代谢物的浓度，并观察到细胞内代谢物库的总浓度约为300 mM。然而，靶向方法通常适用于有限的代谢物，在寻找未知化合物方面效果较差。近年来，一种名为“伪靶向代谢组学”的新方法被开发和应用，它融合了靶向和非靶向方法的优点。伪靶向方法在多反应监测(MRM)模式下使用UHPLC-QqQ/MS系统，其中MRM转换是通过基于UHPLC-HRMS的非靶向方法使用信息依赖性获取方式从样品中获得的。从数千个候选离子对中选择MRM转换是该策略中最耗时的步骤。MRM-Ion Pair Finder是一种系统化的自动化软件，旨在通过MS2谱图中母离子的对齐、提取和还原、特征产物的离子选择和离子融合来获得MRM特征离子对，为伪靶向代谢组学发现生物标志物提供了一种高通量方法。
2.2.3 CE-MS
在微生物代谢组学中，CE-MS是一种分析极性和带电代谢物(如氨基酸、核苷酸、有机酸和糖磷酸盐)的强有力技术。Ohashi等人利用CE-TOF/MS技术描述了缺乏组氨酸的大肠杆菌的代谢组学变化。在组氨酸缺乏的情况下，由于组氨酸水平降低，细胞内组氨酸生物合成的中间产物水平迅速积累。Takahashi等人利用CE-MS研究了牙龈上菌斑和口腔代表性细菌链球菌(Streptococci)和放线菌(Actinomycetes)的中心碳代谢、EmbdenMeyerhof-Parnas途径、戊糖-磷酸途径以及TCA循环。除了五磷酸途径中的4-磷酸赤藓糖外，龈上菌斑含有所有中心碳代谢的靶向代谢物。 优化CE-MS接口以实现更有效的电离，结合预富集技术，使其能够进行单细胞代谢组学。Kawai等人已经开发了一种高效的无鞘离子发射器“nanoCESI”，其灵敏度是常规无鞘发射器的3.5倍。nanoCESI和样品富集方法(通过等速电泳和堆叠的大体积双重预富集)的结合可使灵敏度提高约800倍，从而使检测单细胞中的代谢物成为可能。
综上所述，CE-MS代表了一种高效的微分离平台，可用于极性/离子代谢物的非靶向分析，适用于体积有限的生物样品，样品处理量最少。尽管CE-MS具有这些优点，但其可重复性、灵敏度和长期稳定性阻碍了其在代谢组学中的广泛应用，特别是在负离子模式下进行阴离子代谢物的常规分析时。
2.2.4 DI-MS
DI-MS无需色谱分离和化学衍生化，是高通量代谢组分析的有效替代方法。Mas等人报道DI-MS和GC-MS可以相互补充，提高不同基因型代谢足迹的分辨率。然而，当使用DI-MS作为替代方案时，除了基质效应的固有缺点外，还发现了两大技术障碍：数据对齐和结构注释。为了解决这两个问题，Xu等人开发了一种新的策略，DI-3D-MS，通过执行逐步多离子监测以在第一维度中获取和创建对齐的数据文件。在第二维度，MS2谱通常基于增强的产物离子实验进行记录。在第三维度，在线能量分辨MS生成了所有多离子监测项目的完整视图。
由于其定性和定量的能力，DI-3D-MS将成为高通量代谢组学的适宜选择。典型的DI-MS在使用脉冲质谱分析仪时很少达到100%的占空比，从而导致不必要的样品浪费。因此，已经提出了一种新型DI-MS离子源，即摩擦纳米发电机感应纳米电喷雾电离(TENGi nanoESI)，用于微小代谢组学，仅消耗亚纳升样品。TENGi nanoESI使用非接触式微电极和更高的电压，比传统的DI nanoESI更灵敏。
2.3 样品制备
由于微生物细胞中活性酶和代谢物的快速转化，为了获得准确的结果，微生物代谢组学分析应采用适当且稳定的样品处理方法，包括快速取样、淬灭、提取细胞内和细胞外代谢物(图3)。制备合适的微生物代谢组样品很复杂，每个微生物预处理步骤都必须进行评估或优化。
图3 用于鉴定微生物代谢组学中细胞内和细胞外代谢物的样品制备。
2.3.1 细胞内代谢物分析
2.3.1.1 淬灭
理想的淬灭工艺应满足两个要求：(1)酶迅速失活，(2)细胞保持其完整性。 取样时间和淬灭剂是影响淬灭效率的重要因素。
2.3.1.1.1 采样设备
采样频率和采样速度是人工采样的主要挑战。由于几种代谢物周转迅速，有的半衰期仅为1秒，而有的则是几种代谢反应的中间产物，因此通常难以实现高代谢淬灭效率。目前已研制出几种自动化装置，其中一些可实现取样和淬火同时进行。例如，Schaefer等人开发了一种用于采集和淬灭微生物细胞的自动装置。将培养液连续喷射到装有淬灭剂的管中，并在生物反应器底部以一定速度移动。该系统可处理4.5个样品/秒，实现采样和淬火同时进行。BioScope是为细菌代谢扰乱实验而开发的，由连接在发酵筒上的透氧硅胶管组成，发酵液以一定的速度流过。发酵液离开发酵缸后，用搅拌器搅拌，表明扰动开始。不同的管道位置表示不同的扰动时间。BioScope系统已经升级到第二代，其中气体传输和观察窗口都得到了改进。Rockenbach等人开发了一种基于不可逆电穿孔的采样装置，适用于不同细胞壁和细胞膜特性的细胞。通过脉冲电场处理微流控芯片的流量配置，可在数秒内实现细胞内代谢物的采样、淬灭和和提取。
2.3.1.1.2 淬灭剂
淬灭剂必须穿透细胞膜，这是另一个主要屏障。冷甲醇及其缓冲液常用于微生物的淬灭。与真核微生物相比，细菌等原核生物在用冷甲醇灭活时更容易引起细胞内代谢物的渗漏，而革兰氏阴性菌由于细胞壁结构的差异比革兰氏阳性菌更容易发生渗漏。因此，维持细胞的完整性，防止细胞内代谢物外泄，准确反映微生物细胞的生理状态，是微生物代谢组研究中淬灭时需要考虑的重要因素。VillasBoas等人使用溶解在盐水中的甘油作为微生物细胞的淬灭剂，这可以防止细胞内代谢物的显著泄漏，从而更准确地测定细胞内代谢物。
Japelt等人评估了微生物培养物的三种淬灭方案，即冷甘油盐水、快速过滤和冷缓冲甲醇，并发现冷甘油盐水淬灭对副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)细胞损伤最小，细胞内代谢物回收率最高。以往的研究采用了多种淬灭策略；然而，目前还没有适用于所有微生物代谢组学样品预处理的通用淬灭溶液或程序。
2.3.1.2 提取
在提取过程中，应做到以下几点：(1)尽可能多地无偏差地提取物质；(2)最佳提取回收率；(3)尽量减少或避免代谢物的物理或化学性质的改变。靶向代谢组学的提取方法基于目标代谢物的类型及其化学性质进行优化，而非靶向微生物代谢组学则是根据微生物细胞壁和细胞膜的生理和性质进行优化。革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖层比革兰氏阴性菌厚；酵母的细胞壁由甘露聚糖(外层)、蛋白质(中间层)和葡聚糖(内层)组成，比革兰氏阳性细胞的细胞壁厚。
化学物质(如冷甲醇)通常足以破坏细菌细胞壁。但由于酵母的细胞壁较厚，裂解需要额外的溶剂，如热乙醇和氯仿，以及/或机械损伤。代谢物的提取通常采用物理方法(如超声波、机械、微波、珠打、煮沸、液氮反复冻融)、酶(如溶菌酶)和化学方法(如热乙醇、冷甲醇、热甲醇、氯仿、和高氯酸)来破坏细胞壁。 高通量提取技术已被用于制备微生物代谢组学样品。为了提高裂解和提取步骤的通量和一致性，Filla等人开发了一种仿生细胞培养微流控装置，该装置使用电气和化学组合策略，可以在常规方法十分之一的裂解时间内快速裂解细胞。
Mousavi等人开发了一种用于代谢组学的高通量96叶片固相微萃取方案，以同时提取大肠杆菌的各种疏水性和亲水性代谢物。传统上，真菌和细菌次生代谢物的提取需要准确的分离程序和大量的溶剂，耗时较长。Barkal等人引入了一种使用芯片代谢物提取的微代谢组学平台，从而消除了均质化步骤，并将萃取剂体积减少了1000倍，从而增加了工作流程。
2.3.2 细胞外代谢物分析
细胞外代谢物包含有关不同环境中微生物代谢的重要信息。测量分泌的细胞外代谢物的浓度不需要裂解。在大多数情况下，样品制备只包括培养基和微生物的离心分离。然而，对于多组分培养基，需要高度稀释的培养液或其他样品预处理，如纯化、脱盐、脱蛋白、预浓缩或蒸发，以及后重建过程。 微生物的次级代谢物，尤其是真菌和放线菌的次级代谢物，一直是细胞外代谢物研究的重点。 Clevenger等人建立了一种真菌人工染色体-代谢组学评分方法，可以表达多个全长基因簇。利用该平台筛选了来自不同真菌物种的56个次生代谢物生物合成基因簇，其中发现了15种新的次生代谢产物，并将其分配到生物合成基因簇中。 培养环境，如温度、pH、培养基中的营养物质等，都会影响细胞外代谢物的产生；因此，培养基中消耗的化合物也是代谢组学分析的目标。
Weidt等人开发了一种靶向/非靶向方法来探索白色念珠菌(Candida albicans)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)共感染的代谢效应。使用GC-Orbitrap/MS测定培养基中葡萄糖和果糖的快速消耗以及非蛋白质氨基酸的消耗。Wang等人开发了一种灵活的高通量方法，该方法使用单细胞的微流控培养基于细胞外代谢物的产生或消耗进行选择。对分泌或消耗的代谢物的分析有助于选择酵母和细菌菌株，用于药物和燃料的过量生产。
2.4 数据处理和分析
2.4.1 数据处理
Martin等人开发了一个R包PepsNMR，专门用于1H NMR代谢组学数据的预处理，包括降低溶剂信号、基线和偏差校准、标准化，为每个案例研究提供更好的定量质量标准。缺乏可靠的峰值检测阻碍了大规模GC-MS代谢组学数据集的自动化分析。Borgsmüller等人提出了一种改进峰值拾取(WiPP)的工作流程，用于GC-MS代谢组学数据的参数优化和多算法峰值检测。WiPP使用基于机器学习的分类方案，基于7个峰类别来评估检测到的峰值的质量。
UHPLC-HRMS用于非靶向代谢组学分析的长期挑战是如何从未知的MS特征有效过渡到可靠的代谢物注释 (图4)。为了解决这些问题，设计了许多程序，如Peak Annotation and Verification Engine和compMS2Miner。最近，Li等人开发了NOREVA()，可以标准化MS获得的代谢组学数据，并评估不同标准化方法的适用性。NOREVA已经更新到2.0版本(https://idrblab.Org/noreva/)，可以标准化和评估多种类型的代谢组数据，有144种标准化方法。
图4 微生物代谢组学研究中的数据处理步骤。
2.4.2 数据分析和生物信息学工具
2.4.2.1 数据分析方法
从大量收集的数据中挖掘有价值的信息，并将其与细胞表型联系起来，是微生物代谢组学研究的关键环节和难点之一。虽然主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)是多变量分析中常用的分类或降维方法，但已有研究指出这些方法存在局限性。例如，PLS-DA容易过度拟合，可能产生错误的结果；同时，PCA没有相关的概率模型，使得难以评估PCA与数据的拟合度，从而限制了其应用。此外，PCA不能显示数据中的基础受试组，从而提供了基础数据结构的错误视图，并且无法正确处理缺失的数据。
因此，提出了一些新的统计分析方法来克服这些限制。例如，Kim等人开发了MetaPCA和稀疏MetaPCA框架，该框架可以结合多个组学数据集来识别一个共同的特征空间来进行降维。Nyamundanda等人引入了概率主成分和协变量分析，这有助于代谢组学数据和协变量的联合建模，并提供对基础数据结构的见解。人工神经网络是一种基于非线性投影的机器学习方法，在结构上等同于PLS。Mendez等人已经证明，在代谢组学数据处理过程中，可以将标准化的PLS-DA工作流程迁移到简单的非线性人工神经网络。
2.4.2.2 生物信息学工具
生物信息学工具是处理代谢组学数据的重要工具。Cleary等人开发了一种新算法BLANKA，用于复杂生物样品MS中的空白减法，可以解决由于介质中复杂组分而导致的高背景问题。Simader等人开发了QCScreen工具，该工具用于检查基于LC-MS代谢组学的实验数据的有效性，并检测假定的误差来源，例如保留时间或质量准确度的变化。使用QCScreen生成的结果详细说明了所有分析样品的质量，包括色谱分离、质量准确度和检测器灵敏度。一种重要的生物信息学技术IDBac是由Clark等人设计的，使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)-TOF/MS分析从琼脂平板上获得的单个细菌菌落记录的特定代谢物光谱和蛋白质。Zhang等人开发了一种综合的GC-MS数据自动化分析方法autoGCMSDataAnal，该方法可以以采集的原始GC-MS数据文件为输入，自动实现TIC峰检测、成分分辨率、时移校准和成分配准、统计分析和化合物鉴定。
除了上述平台外，使用Python、Matlab、C++、R、Java和Web构建的其他生物信息学工具，如VOCCluster、SIRIUS 4、Metandem、AutoTuner和mzTab-M，已被开发用于分析代谢组学数据。近年来，微生物组与代谢组之间的相关性得到了广泛的研究。还开发了网络资源，如AMON、M2IA和MiMeNet，用于整合分析微生物组和代谢组之间的关系。
为了促进多组学研究，人们提出了用于组学数据综合可视化和分析的新工具，包括PaintOmics 3、trackViewer、VANTED和BIOMEX。除上述外，其他代谢组学数据分析软件和生物信息学工具如表1所示。 表1 代谢组学数据分析软件和生物信息学工具。
2.4.3 生物学解释
代谢物的鉴定是微生物代谢组学分析中的一个具有挑战性的过程。2016年，一个数据驱动平台，用于在群落范围内组织和共享原始、处理或识别的串联质谱(MS/MS)光谱数据，称为全球天然产物社会分子网络，由来自52个实验室的研究人员联合提出。GNPS可以帮助分析数据集并将其与所有公开可用的数据进行比较，因此已成为识别多种菌株和条件下主要化合物类别的重要工具，但结果仍然需要验证。Shen等人开发了一种基于代谢反应网络的递归算法(MetDNA)，无需全面的标准光谱库即可扩展代谢物的注释。
Erbilgin等人开发了MAGI，其利用生化反应网络整合代谢物注释和基因，生成代谢-基因关联评分。MetNet与xcms/CAMERA套件的输出兼容，已开发用于代谢物注释。此外，用于代谢物鉴定的常用微生物代谢组学数据库有大肠杆菌代谢组数据库、酵母代谢组数据库、大肠杆菌基因与代谢百科全书、国家微生物数据库等。微生物代谢组学数据可以通过MetaCyc、Reactome、PANTHER和京都基因与基因组百科全书(KEGG)等生物数据库来可视化代谢途径和代谢网络。
这更好地解释了代谢物之间的关系，并可以与功能基因组学研究的基因表达数据相关联。了解代谢途径，包括与代谢物相关的反应，有助于正确解释代谢组学数据。Jijakli等人构建了链球菌突变体UA159的基因组规模代谢模型iSMU，该模型包含675个反应，涉及429个代谢物和493个基因产物。Aminian-Dehkordi等人提出了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM319、iJA1121的基因组规模代谢模型，其中包括1709个反应、1349个代谢物和1121个基因。将统计分析、通路分析软件和数据库相结合，有助于研究人员发现代谢通路的变化，更好地解读生物学信息。
3 微生物代谢组学的应用 微生物代谢组学在功能基因研究、微生物鉴定、代谢途径、抗生素耐药性、工业生物技术、合成生物学和酶发现等方面有着广泛的应用。此外，它在发现天体生物学相关生物标志物和探索地外生物方面的应用也开始引起科学家的注意(图5)。
图5 微生物代谢组学的多样化应用 。
3.1 确定未知基因的功能
目前，科学家已经阐明了许多基因的功能，但还有许多基因的功能仍然未知。代谢组学是基因型与表型之间的直接联系。通过分析不同遗传条件下代谢物的变化，可以确定不同未知基因的功能，是后基因组时代微生物代谢组学的重要研究内容之一。如果两个基因的代谢表型相似，那么这两个基因可能具有相同的功能。
在这种情况下，未知基因的功能可以通过与已知基因的功能进行比较来推断。Tian等人对缺乏sdhAB和ackA-pta的大肠杆菌突变体及其野生型菌株进行了GC-MS代谢组学分析。大肠杆菌的sdhAB和ackApta可能与琥珀酸、天冬氨酸和脯氨酸的调节有关，sdhAB基因的缺失可能会对大肠杆菌的生长产生很大影响。Wang等人通过对代谢谱数据的统计和生物信息学分析，开发了一种优化的GC-MS方法，用于研究野生型大肠杆菌yfcC基因过表达和缺失突变体之间的代谢差异。未知功能基因yfcC在大肠杆菌中的表达可影响乙醛酸分流的代谢，从而上调乙醛酸分流关键基因aceA和aceB的表达。
3.2 微生物鉴定
代谢物是微生物生命活动的最终产物。不同的微生物可能产生不同的代谢组。因此，利用代谢组学分析方法研究微生物代谢物的差异，可以识别出不同菌株，用于微生物的检测。该功能可应用于病原微生物的检测，特别是食品中的病原微生物，对于减少与食品有关的疾病爆发和问题产品的召回至关重要。Nasstr om等人对伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)甲型感染患者和无症状对照者的血浆进行了GC×GC-TOF/MS分析，鉴定出695个单独的代谢物峰，可以准确确定病原体的类型。Kang等人采用LC-MS/MS和多变量统计方法分析了7种木霉属物种(Trichoderma)(33株)的次生代谢物，并对木霉进行了分类。标准基质辅助激光解吸/电离MALDI-TOF/MS技术革新了微生物物种鉴定。
MALDI-TOF/MS的分辨率允许在物种水平上准确识别大多数菌株。真菌(如酵母)，可以用MALDI-TOF/MS鉴定，这比传统技术要快得多。Neumann-Cip等人采用基于过滤的化学提取技术，利用MALDI-TOF MS测量Borrelia spp.光谱。以13种Borreliaspp.的49个分离株为样本，建立了一个大型质量文库，可将96%的分离株正确鉴定到种水平。近年来，具有更大动态范围和更高准确度的超高分辨率MALDI-FTICR/MS也被用于鉴定和区分临床相关菌株，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
3.3 微生物代谢途径
对于一些模式菌株，如大肠杆菌和酵母，虽然已经创建了非常详细的代谢网络图，但仍然存在一些未知的初级或次级代谢过程。通过代谢组学的研究，我们可以了解微生物复杂多样的代谢途径，分析各种反应变化，研究代谢途径和差异。Ohtake等人利用代谢组学驱动的方法显示了由pta缺失引起的CoA失衡，并研究了CoA失衡与大肠杆菌中1-丁醇产生之间存在一定的相关性。Mccloskey等人构建了一个用于厌氧培养的快速采样装置。通过对代谢模型的整合，发现大肠杆菌利用一种非常规途径，通过β氧化途径合成脂肪酸。此外，这项研究发现了pykA基因的酶混杂，这对厌氧生长至关重要。Fei等人比较了中间链霉菌(Streptomyces)菌株B196在厌氧和好氧条件下的总代谢组学和转录组学特征，发现在好氧条件下，氧化应激反应基因诱导的转录变化最大。在厌氧条件下，适度调节代谢可支持中间链球菌菌株B196在缺氧条件下加速生长。
最近，Rappez等人提出了一种新方法SpaceM，该方法每小时可以从>1000个单个细胞中检测>100个代谢物，以说明单个细胞的代谢状态。SpaceM可用于研究多细胞模型并使单细胞代谢组学大众化。 代谢组学与代谢通量分析(MFA)或代谢控制分析相结合，可以阐明代谢途径的综合功能。确定代谢途径的准确作用和活动是代谢工程的关键。Jacobson等人成功地将代谢组学与2H和13C MFA结合，以评估代谢反应的可逆性和吉布斯(Gibbs)自由能。这项研究确定了Entner-Doudoroff途径，这是一种在运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)中比在大肠杆菌或酿酒酵母(S. cerevisiae)中的Embden-Meyerhof-Parnas途径更有利的代谢途径。该途径可以解释通常在运动发酵单胞菌中观察到的糖酵解速率升高。
同样，Jacobson等人还利用13C和2H示踪剂进行了MFA定量代谢组学分析，分析了热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和Thermoanaerobacterium saccharolyticum的糖酵解热力学。为了研究谷氨酸对高产β-半乳糖苷酶毕赤酵母(Pichia pastoris)中心碳代谢的影响，Liu等人使用LC-MS/MS和GC-MS结合13C辅助代谢组学和13C MFA。为了提高大肠杆菌中甘油的丙酮醇产量，Yao等人利用13C MFA确定了丙酮醇过量生产的限制条件，并得到了代谢组谱的支持。Volke等人利用代谢控制分析和靶向代谢组学对大肠杆菌中表达异戊二烯合成酶基因的甲基赤藓糖醇磷酸途径进行了检测，并确定了微生物产生类异戊二烯途径代谢工程的关键因素。
3.4 抗生素耐药性 随着抗生素的广泛过度使用，药物选择对细菌的压力加大，导致多种病原菌的耐药菌株、多重耐药菌株、泛耐药菌株的出现，这给人类医学和动物医学对细菌性疾病的临床治疗带来了挑战。细菌的代谢状态显著影响其对抗生素的相对易感性。在外界环境发生变化的情况下，细菌会通过调节自身的新陈代谢来适应环境条件以生存和繁殖，并具有适应性补偿。 Allison等人发现糖酵解的上游代谢物(如葡萄糖、甘露醇、果糖)与庆大霉素联合使用比单独使用庆大霉素能更好地杀灭耐药大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。这些代谢物通过激活电子传递链来增加质子动力，从而增加氨基糖苷类的摄取，从而增加细胞内抗生素的浓度。
Mielko等人通过比较耐药性和耐药敏感性铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)之间的胞内和胞外代谢产物，发现细胞内氨基酸库的显著代谢变化。Peng等人研究了卡那霉素耐药菌Edwardsiella tarda的代谢变化，发现外源葡萄糖或丙氨酸可促进耐药菌的TCA循环。它还提高了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产生和质子动力电位，并促进了耐药菌对抗生素的敏感性。该小组还进行了几项微生物代谢组学研究，包括发现丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸分解代谢途径在抗血清大肠杆菌中下调，而外源甘氨酸可逆转血清抗性并增强血清以消除临床病原菌；谷氨酸增强氨基糖苷类的功效，丙酮酸循环为E. tarda和大肠杆菌提供呼吸能量。Jiang等人发现金黄色葡萄球菌的耐药表型是由于心磷脂生物合成增加引起的，导致细菌膜中心磷脂水平升高，磷脂酰甘油水平降低，改变了膜磷脂结构并破坏了达托霉素的渗透和膜破裂。
3.5 环境微生物代谢与群落
环境微生物群落是生态系统的重要组成部分。代谢组学和宏基因组学的结合可以表征环境微生物群落及其功能。Ofaim等人引入了微生物高通量代谢组学和宏基因组学数据整合框架，以解决微生物群落结构、群落功能和代谢输入之间的复杂关系。Wiseschart等人研究了一个地下石灰岩洞穴土壤中微生物的分类组成和代谢潜力。高通量鸟枪法宏基因组测序结果表明，放线菌(Actinobacteria，51.2%)和γ-变形菌(Gammaproteobacteria，24.4%)是洞穴土壤群落的优势菌群。代谢分析表明，氧化磷酸化(28.8%)是主要的代谢途径，其次是甲烷代谢(20.5%)、固碳(16.0%)、氮代谢(14.7%)和硫代谢(6.3%)。
3.6 肠道微生物代谢与疾病
肠道共生微生物及其代谢产物已被证明在各种疾病的发病机制中起着重要作用。肠道微生物产生三甲胺-N-氧化物、短链脂肪酸、长链脂肪酸、4-乙基苯基硫酸酯、吲哚、多胺、视黄酸、胆汁酸、类黄酮和N-酰基酰胺等。非靶向代谢组学新技术的发展，使表征与人类疾病相关的肠道微生物及其代谢物成为可能。Liu等人发现自闭症谱系障碍(ASD)患者的肠道微生物群和短链脂肪酸组成不同。
特别是，ASD患者粪便的乙酸和丁酸水平较低，而粪便戊酸水平较高。ASD患者中产生丁酸的关键分类群较少，而戊酸相关的细菌较多。据报道，肠道微生物代谢和心理健康之间也存在联系。最近的一项研究报道，肠道微生物群的特征与抑郁和宿主的整体生活质量相关。粪便宏基因组的肠-脑模块分析表明，多巴胺代谢物3,4-二羟基苯乙酸的微生物合成潜力与心理健康的整体质量呈正相关，这表明微生物γ-氨基丁酸的产生可能在抑郁症中发挥作用。
3.7 工业发酵的改进
微生物代谢组学可以与稳定同位素示踪、通量测量、转录组学和蛋白质组学相结合，揭示代谢动力学和代谢关系，了解菌株在发酵过程中的代谢状态，从而提高菌株的性能，促进工业发酵的改进。通过研究微生物代谢组，可以发现特定的代谢状态，从而提高代谢工程的目标生产率。Gold等人通过靶向代谢组学确定了3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶的可能调控位点，并发现了苯甲酸脱氢酶的另一个辅助因子限制。此外，设计的代谢模型确定了提高DAHP合成酶4-磷酸赤藓糖和预苯酸脱氢酶辅助因子利用率的策略，为进一步提高酿酒酵母芳香族氨基酸的生物合成提供了途径。Sakihama等人检测到酿酒酵母(S. cerevisiae)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中糖酵解和TCA循环的整体代谢周转，发现在酿酒酵母中，丙酮酸代谢在有氧条件下倾向于产生乙醇，而M. maxluyveris中乙酰-CoA合成增加；酿酒酵母的苹果酸和富马酸的产率高于M. maxluyveris。此外，有氧条件下已糖激酶活性的降低对于维持适当的碳通量至关重要。
3.8 合成生物学
合成生物学利用基因和基因组技术设计、修改、重建或制造生物分子、生物成分、生物反应系统、代谢途径和过程，生物合成具有生物活性的药物、高价值化学品和天然产物。微生物代谢组学研究微生物的代谢通量，调控中心碳代谢，确保目标化合物的合成与维持细胞动力学和能量平衡相一致，以促进生物合成。Wang等人应用代谢组学和转录组学方法来说明三酰基甘油(TAGs)在初级代谢过程中积累，在稳定期降解。这可以将来自细胞内TAG和胞外底物的碳通量引导至聚酮化合物的生物合成。一种被称为TAG的动态降解策略已被证明可以激活TAG池并加速聚酮化合物的生物合成。Zhang等人检测了培养基中添加和不添加谷氨酸的紫红曲霉(Monascus purpureus)的代谢组学特征。添加外源柠檬酸以确定合成莫纳可林K的效果，结果发现苹果酸、富马酸和柠檬酸可加速莫纳可林K的产生。相反，乙酰辅酶A的合成由于α-酮戊二酸的积累而受到抑制，进而抑制了莫纳可林K的合成。为了提高酿酒酵母对1-丁醇的耐受性，Teoh等人对19种在1-丁醇胁迫下具有不同生长速率的酵母突变株进行了非靶向代谢组学分析，发现苏氨酸和柠檬酸分别与生长速率呈正相关和负相关。此外，根据这些代谢产物，可以区分出在胁迫下生长速率较高的新突变株。
3.9 酶的发现
广泛的代谢分析和基因表达分析已被证明是识别候选基因和酶(特别是次生代谢酶)的有效方法。Saito等人利用CE-MS研究代谢物组成的变化，并通过代谢物组成的变化了解酶的存在。作者利用该方法研究了大肠杆菌代谢酶，然后研究了功能未知的酶。YbhA和YbiV蛋白在不同的糖/糖磷酸盐上表现出磷酸转移酶和磷酸酶活性。 Sevin等人开发了一种基于MS的高通量分析方法，可以在体外综合分析蛋白质的酶活性。过表达或纯化的蛋白在含有数百个代谢组的提取物中孵育，并使用非靶向代谢组学来确定积累和消耗的代谢物。在1275种功能未知的大肠杆菌蛋白中发现了241种潜在的新酶，其中12种已得到验证。这种高通量方法适用于纯化蛋白或过表达宿主粗细胞裂解液的非靶向酶分析。
3.10 天体生物标志物
在过去的40年中，科学家们一直在努力探索火星上的有机化合物。最新数据表明，在火星浅层地下存在有机化合物。区分生物分子和非生物分子对寻找地外生命至关重要。代谢组学技术为寻找外源生物化学成分、鉴定和定量微生物群落中的代谢物或生物标志物提供了一种公正的方法。这些有机物质的存在可能预示着远古或灭绝的生命，这极大地促进了天体生物学的发展。
结论
本篇综述讨论了微生物代谢组学的现状：从新的分析技术到样品制备、数据分析和多样化的应用。微生物代谢组学的发展虽然刚刚起步，但近年来取得了突破性进展，微生物代谢组学在生命科学中的重要性明显上升。代谢组学在微生物研究中的应用不仅丰富了生物化学方面的知识，还促进了基因组学、转录组学和蛋白质组学的发展。随着分析工具、工作流程、样品制备和数据分析方法的最新发展，微生物代谢组学将在不久的将来得到更广泛的应用。
